Анализ эволюции и экспрессии генов человека

ОПИСАНИЕ

В этом году вы научились проводить филогенетический анализ белок-кодирующих и некодирующих генов. И теперь вам предстоит провести небольшое исследование самостоятельно. Вам будет предложен список генов, из которого вы и выберете свой будущий объект для анализа. Программы и методы вы можете выбирать самостоятельно в зависимости от ваших предпочтений, а результаты нужно будет оформить в виде классической научной статьи.

Итак, вам потребуется произвести поиск ортологичных последовательностей гена в геномах различных живых организмов, входящих в эволюционную линию человека, визуализировав результат в виде филогенетического древа, и сделать вывод об эволюции этой последовательности. То есть сделать приблизительно то, что вы уже делали в первом задании. Тем не менее, будет несколько отличий. Во-первых, больше видов. Здесь вы делаете уже полноценное филогенетическое исследование, а значит нужно увеличить разрешение метода, добавив в анализ больше геномов. Во-вторых, да, именно геномов. Поиск по транскриптомам вносит существенное ограничение на точность анализа. Предковая последовательность белок-кодирующего гена как правило экспрессируется далеко не сразу после своего возникновения, у неё может не быть промоторов и рамки считывания, и следовательно она будет отсутствовать в транскриптомных базах, хотя эволюционно уже появилась. В-третьих, нужно будет разделить обнаруженные ортологи и паралоги, это делается очень просто, достаточно посмотреть на окружение гена, если оно одинаковое у двух видов — это ортолог, если разное — паралог. Такой анализ можно делать при помощи скриптов, а можно руками в геномном браузере, например, как здесь. На этом отличия, пожалуй, и заканчиваются.

Немного полезной литературы:

• Значения терминов “гомолог”, “ортолог” и “паралог”

• Основы поиска гомологов

• Основы филогенетического анализа

• Основы биоинформатики

• Основы эволюции

• Основы основ

Ссылки на тулы и базы:

• tBLASTn — поиск гомологов в нуклеотидных базах с аминокислотной последовательностью в качестве ввода

• MAFFT — программа для множественного выравнивания

• Ensembl — база данных, содержащая геномы, транскриптомы, протеомы различных живых организмов, нуклеотидные и аминокислотные последовательности генов и их белков, а ещё там есть BioMart, который поможет вам вытянуть почти любую информацию почти про любой ген.

• Конвертер форматов — web версия программы для конвертации .fasta в .nexus.

• Seqmagick — программа для конвертации .fasta в .nexus.

• Lifemap — филогенетическое дерево живых организмов. Позволяет посмотреть взаимное эволюционное расположение видов из всех трёх доменов жизни. В строку поиска можно вводить латинское название вида.

• TimeTree — ещё один сервис по филогении, он поможет вам узнать время возникновения видов, таксонов и даже солнечную активность и концентрацию углекислого газа в разные геологические эпохи.

Ход работы по филогенетическому анализу гена:

Перечисленные ниже действия опциональны, при желании вы можете выбрать другие инструменты. Основная задача — получить результат.

1. Выбрать ген или смириться с назначенным (список генов в таблице)

2. Получить нуклеотидную последовательность гена

3. Сохранить последовательность в текстовом файле с расширением .fasta

4. Скачать геномы выбранных организмов с ensembl.org. Геномы тоже лучше скачивать скриптом через rsync. Адрес опять же однотипен и тоже содержит латинское название вида, которое можно использовать, как переменную. Например, для шимпанзе путь к файлу с геномной последоваельностью выглядит так:

/pub/release-113/fasta/pan_troglodytes/dna/*dna.toplevel.fa.gz 

5. Скрипт может выглядеть как-то так:

#!/bin/sh

s_list='species.txt'

while read species; do

    rsync -av rsync://ftp.ensembl.org/pub/release-113/fasta/${species}/dna/*dna.toplevel.fa.gz

done < ${s_list}

Но обратите внимание, что версия базы постоянно обновляется, поэтому вместо release-113 может понадобиться подставить более свежий релиз.

6. Преобразовать .fasta файлы в базу .hmm. HMMER в любом случае будет генерировать такую базу на основе геномной последовательности, но при каждом новом выравнивании заново, поэтому для экономии времени лучше сгенерировать её заранее и один раз. Чтобы не вводить команду 11 раз, удобнее сделать скрипт, взяв путь к геному в качестве переменной.

7. Если вы ленивы или нетерпеливы, то готовые геномные базы можно скачать тут.

8. Подождать, выпить чай. Возможно, поспать. Генерация .hmm базы занимает весьма много времени, а если компьютер не очень мощный, то придётся подождать пару часов. Можете посмотреть, если ещё не видели, Black Books.

9. Подождать, выпить чай, подумать над литобзором будущей публикации и смыслом жизни

10. Запустить выранивание нуклеотидной последовательности на геномы в программе nHMMER. Удобнее это делать скриптом, взяв путь к базе в качестве переменной. Описание команды запуска и назначение ключей описано ниже. Если вы ленивы, то скрипт можно взять тут.

11. Подождать, выпить чай. Начать смотреть второй сезон Black Books. HMMER суров и молчалив, как норвежские боги, и не говорит о прогрессе выравнивания.

12. Среди обнаруженных последовательностей нужно выбрать только соответствующие пороговому значению по e-value (e-10 для нуклеотидных выравниваний, а вообще, ну прочитайте вы ту статью).

13. Получить геномные координаты подходящих последовательностей из TSV файла, перевести их в .bed формат

14. Получить нуклеотидные последовательности по координатам при помощи программы getfasta.

15. Рассортировать обнаруженные последовательности на ортологи и паралоги, исходя из их окружения (видео сбоку). Добавить в заголовок паралогов метку "paralogue".
    Этот пункт опционален

16. Проверить, нет ли дупликатов этого гена в геноме человека. Это нужно, во-первых, для более полного описания гена, а, во-вторых, позволит корректнее построить дерево. Для этого нужно сделать выравнивание последовательности выбранного гена на геном человека при помощи nhmmer.

17. Добавить обнаруженные последовательности в созданный ранее .fasta файл. 

18. Убрать из заголовков в скачанном файле все символы кроме букв "A-Z", цифр "0-9", underscore (_ подчёркивание) и скобки ">" в начале, заменив их на underscore. И хватит уже забывать про длину строки, которая не должна превышать 99 символов

19. Добавить в файл последовательность исследуемого Вами гена человека, не забыв отформатировать заголовок и в ней.

20. Убрать из заголовков в скачанном файле все символы кроме букв "A-Z", цифр "0-9", underscore (_ подчёркивание) и скобки ">" в начале, заменив их на underscore. И хватит уже забывать про длину строки, которая не должна превышать 99 символов

21. Double-double-check

22. Точно проверили?

23. Запустить множественное выравнивание в MAFFT с использованием алгоритма E-INS-i.

24. Сконвертировать полученный .fasta файл в формат .nexus в web-конвертере или в seqmagick. При использовании консольной версии seqmagick:
    seqmagick convert --output-format nexus --alphabet dna YOUR_FILE.fasta YOUR_FILE.nexus

25. Провести реконструкцию филогенетического дерева в Mr.Bayes по параметрам, описанным справа

26. Открыть сгенерированное дерево в редакторе FigTree или iTOL на ваш выбор, выбрав файл с расширением .con.tre.

27. Проанализировать дерево, его биологическую корректность

28. Сделать вывод о возрасте гена, эволюционным событиям, произошедшим с его предковыми последовательностями. Здесь вам, возможно, потребуется понять, какой вид к какому таксону принадлежит. Для этого можно зайти вот сюда. А если хочется погрузиться в филогению, то можно позалипать в Time Tree. Time Tree, кстати, может вам даже дерево для списка видов нарисовать

29. Отредактировать дерево, выбрав шрифт и кегль, при необходимости покрасив клады в разные цвета на основании их родства.

30. Оформить полученные данные в виде текста в разделе "Результаты".

31. Провести анализ литературы, сопоставив Ваши данные с литературными. Если таковых нет, то вы только что впервые провели филогенетический анализ этого гена. Congrats!